A noite apareceu no Instituto Smithsonian em Washington, EUA. Os guias já foram para casa, as luzes estão apagadas, as crianças estão colocadas para dormir… Ainda assim, algo está acontecendo enquanto o ex-vigia noturno Larry Daley (Ben Stiller) se descobre atraído por sua mais assombrosa e maior aventura até o momento, na qual a História verdadeiramente ganha vida.